带你深度揭示肼类基因毒杂质的奥秘

带你深度揭示肼类基因毒杂质的奥秘 。
地拉罗司 解读：去铁酮片和地拉罗司哪个好。导语：
我们在上一篇文章中(干货｜教你全面玩转磺酸酯类基因毒杂质)向大家介绍了磺酸酯类基毒杂质的种类、检查方法及控制，本篇主要对肼类基因毒杂质进行详述。概述：肼或烷基肼/苯基肼常用作制药中的原料合成中间体或API，例如氨基脲、异烟肼、呋喃西林、盐酸阿齐利特、硫酸阿米卡星等。肼类化合物有巨毒，能够对肝、肾、血液等系统带来很大的药副作用。有数据资料显示，肼是已知的基因毒性杂质，具有潜在的致癌性，肼类化合物主要是通过代谢活化而生成碳正离子和碳氧自由基等活性较强的中间体，可与DNA发生烷基化反应或者导致DNA其他病变。图1. 肼类化合物结构式基因毒性杂质或者潜在基因毒性杂质严重威胁人类健康，关于怎样严格控制药物中这类杂质的限度或要求在我们之前的文章已有阐述，在此不做详述。欧洲药典和美国药典中列出了部分以肼作为原料的药物中，肼的允许限值(根据治疗期及服用剂量来计算)范围是从1 ppm到1000 ppm，因此，对检查方法的灵敏度要求有一定差异。由于此类杂质，如甲基肼、二甲基肼等具有强活泼性、挥发性、分子量小等一些特别的化学性质，故检查方法在灵敏度、选择性、待测物稳定性、基质复杂性等方面呈现特别要求，因此在分析方法的开发和选择上具有与其他药物杂质检查不同的特征。除此之外，肼类化合物容易与色谱柱上的硅氧基互相作用，导致峰形严重拖尾，是分析方法建立过程中的难点。因此，建立一种快速、简便、高灵敏的检查方法来监控药物生产过程中肼类基毒杂质的残留量显得愈加紧迫。根据参考各国药典及文献，总结了部分含有肼类基毒杂质药物的种类，详见表1。表1. 含有肼类基因毒杂质药物列表

常用的检查方法:直接进样法：相关资料显示，对于挥发性较强的烷基肼，一般经常采用GC-FID法进行直接测定；对于不含碳原子的肼类化合物，能够采用氮磷检查器(NPD)和质谱检查器进行测定；而对于在色谱柱上保留较强的肼类化合物，能够采用高效液相色谱-质谱法(LC-MS)进行测定。由于肼类化合物是一种质子碱，能够在酸性溶液中离子化，因此也可采用离子色谱法测定这类易电离的化合物，如离子交换色谱-电化学检查器(IEC-CD)、离子交换色谱-安培检查器(IEC-AD)，但是常规的离子色谱直接测定药物中肼类基毒杂质的残留时，经常会存在检查灵敏度较低的问题，因此目前不作为常用方法来考虑。但也有文献报道，利用氮化学发光检查器(HILIC-CLND)测定烷基肼类基毒杂质时，检查限及灵敏度亦能够达到要求。衍生化法：对于甲基肼、二甲基肼等这类具有挥发性、分子量小、化学性质活泼或无助色基团的化合物，衍生化法则是测定该类化合物的主要方法之一。而苯甲醛为最常用的衍生化试剂，衍生化后采用HPLC-UV、GC、LC-MS等方法测定衍生物，该方法样品前处置简单、高效且具有很高的灵敏度。USP中就采用了苯甲醛衍生化后，HPLC-UV直接进样检查盐酸肼苯哒嗪中肼的残留量。除此之外，还能够用丙酮或者氘代丙酮作为衍生化试剂，衍生化后采用HS-GC-EI-MS进行残留量测定。提供以下两个案例可供借鉴塞来昔布：塞来昔布(化合物1，图2)，是一个磺胺类非甾体类抗炎药(NSAID)，是美国Searle公司推出的第一个特异性2型环氧化酶抑制剂(COX-2)，可用于治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、急性痛苦、痛经等月经病症等。通过抑制环氧化酶阻止炎性前列腺素类物质的产生，可显著减少胃肠道的不良反应。无论对于急性创伤外伤导致的急性痛苦，还是外科外科手术后的止痛，都是理想的镇痛药物。在塞来昔布的合成工艺(图2)中，一般以对甲基苯乙酮和三氟乙酸乙酯为原料经Claisen缩合反应制得中间体，然后与对苯磺酰胺基苯肼盐酸盐反应制得塞来昔布，因此塞来昔布原料药中可能存在对磺酰胺基苯肼盐酸盐(SHH，化合物5，图2)及(对甲基苯乙酮)对磺胺苯肼盐酸盐(MAP，可能为反应过程中的副产物)，这两种化合物结构与已知基因毒杂质有类似性，须严格控制其毒理学【关注我们请加微信：yaodaoyaofang 】阈值(TTC)。该药物一般通过口服摄入，最大每天剂量为200 毫克，根据ICH发布基因毒性杂质的最大摄取量为1.5μg/d计算，对应的两种基因毒性杂质的总TTC水平为7.5 ppm。因此，利用LC-MS/MS的方法同时测定两种杂质，以醋酸铵-乙腈作为流动相，根据ICH指导要求，对方法进行了检查限(LOD)、定量限(LOQ)、线性、精密度、准确性等相关验证，两种杂质在0.06~7.5 ppm的范围内均成良好的线性关系，相关系数R2>0.9998，两个杂质的LOD和LOQ分别能够达到0.02 ppm及0.06 ppm，回收率在95%~104%之间，该方法简单、准确，适合在痕量水平下对塞来昔布进行质量控制。图2. 塞来昔布的合成工艺地拉罗司：地拉罗司(化合物5，图3)是一种新型铁螯合剂，通过与体内的铁离子结合，有效的提高铁的排泄，减少体内铁的含量，可减少由铁超载引发起的组织损伤及多个脏器的功能损害，由FDA批准面市。地拉罗司的合成是以水杨酸为原料，经氯化亚砜氯化得到水杨酰氯，水杨酰氯与水杨酸酰胺在高温减压蒸馏的条件下得到中间体8(图3)，最后再与对羧基苯肼环合制备而得到成品。事实上，所用的原料对羧基苯肼(化合物10，图3)已经被证实具有潜在的遗传毒性和致癌性，因此，依据EMA和FDA相应的指导原则，有必要对地拉罗司中的对羧基苯肼进行定量分析。因此，利用HPLC-UV的方法直接进样检查，以高氯酸-乙腈为流动相(用0.1%的三乙胺溶液调节pH)，在该方法下对羧基苯肼的LOD和LOQ分别为0.16μg/mL和0.5μg/mL，在0.5~1.5μg/mL的浓度范围内均成良好的线性关系，相关系数R2>0.999，收率在102%之间。该方法快速、简单、准确，省去了衍生化复杂的操作步骤，且符合检查的要求。图3. 地拉罗司合成工艺总结：肼类化合物作为潜在的基因毒性杂质，大多是从起始物料或者中间体中直接带入或者从合成副反应中引入，因此在生产过程中要对其进行相应的控制，建立合适的质量标准和已验证的分析方法对杂质进行痕量残留检查是非常重要的。若药物活性成分生产的最后一步合成步骤用到了肼类物质，应将其纳入危险分析。但在实际生产中，需要对合成路线进行筛选，应尽量避免使用到GTI/PGI，所以尽可能开发能够控制这些缺陷的替代合成路线。如果在技术上不可行，这就要求我们对整个可能会产生基毒杂质的环节进行详细的控制，必须根据TTC概念确定安全限度，并且建立合理的分析方法去检查和量化这些基毒杂质的残留量，使其符合安全的需要。目前，基因毒性杂质控制是药物质量控制的核心内容之一，而合成过程中基因毒杂质的鉴别与控制由于它们的演变性和不确定性，将会带来非常大的挑战。因此必须从制备工艺和产品结构分析入手，评估、预测产品中可能存在的副产物、中间体、降解物以及试剂、催化剂等，这才是保证药物安全的关键要素，也是确保药物研发中危险控制意识的重要体现。来源：诺衡分析瑞士诺华NOVARTIS，印度CIPLA产地拉罗司分散片——印度全球直邮药房：恩瑞格价格。